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人們對嵌合抗原受體（CAR）T細胞（CAR-T）治療實體惡性腫瘤的前景產(chǎn)生了極大的興趣，多項臨床試驗正在進行中。然而，由于缺乏腫瘤特異性靶點，這些臨床試驗的范圍受到了限制。一旦與抗原結(jié)合，CAR就會啟動強勁的T細胞激活，隨后通過通常包含CD3ζ和共刺激序列元件的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域?qū)Π屑毎�進行殺傷。腫瘤特異性對于CAR療法的成功和安全使用至關(guān)重要。靜脈注射抗ErbB2 CAR-T細胞導致了轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者出現(xiàn)致命性毒副作用，因為CAR-T細胞在肺部激活后出現(xiàn)了不受控制的細胞因子釋放綜合癥（細胞因子風暴）。然而，ErbB受體仍然是有吸引力的腫瘤相關(guān)靶點，因為它們在許多癌癥中都有表達或過度表達。

在一項新的研究中，英國研究人員研究了利用腫瘤缺氧作為CAR-T細胞在腫瘤微環(huán)境（TME）中特異性激活的物理線索的機會，其中腫瘤缺氧是大多數(shù)實體瘤的共同特征。他們發(fā)現(xiàn)，在嚴格的缺氧感應(yīng)安全開關(guān)（hypoxia-sensing safety switch）的控制下表達CAR，可以避免CAR-T細胞的非腫瘤組織在靶激活（on-target, off-tumor activation，即脫靶激活），同時提供高效的抗腫瘤殺傷。這項研究提供了一種方法來克服利用CAR-T細胞治療實體惡性腫瘤的一個主要障礙。相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在2021年4月20日的Cell Reports Medicine期刊上，論文標題為“Hypoxia-sensing CAR T cells provide safety and efficacy in treating solid tumors”。

為了研究CAR-T細胞脫靶激活的問題，這些作者使用了第二代泛抗ErbB CAR T1E28z，即T4-CAR，它對9種可能的ErbB受體同源和異源二聚體中的8種具有特異性，并能跨越物種屏障，與人類和小鼠ErbB受體等效結(jié)合。T4-CAR共同表達一種嵌合細胞因子受體（4αβ），當與IL-4結(jié)合時，就將IL-2/IL-15信號傳遞到細胞外結(jié)構(gòu)域，從而提供了一種在體外擴增時選擇性地富集CAR-T細胞的方法，而不影響這些細胞的CAR依賴性殺傷能力。T4-CAR已被證明對頭頸部鱗狀細胞癌（HNSCC）患者的瘤內(nèi)遞送是安全的，但治療轉(zhuǎn)移性疾病的患者需要靜脈注射。

然而，在臨床前，將人T4-CAR-T細胞輸注到攜帶表達ErbB1-4的HN3腫瘤的NSG小鼠體內(nèi)，可導致致命的毒性，這些動物的體重迅速下降就是證明。正如在臨床上觀察到的那樣，這些小鼠的血液分析顯示了細胞因子風暴的證據(jù)。通過使用亞致死劑量的同時表達熒光素酶（Luc）的CAR-T細胞，這些作者評估了這些細胞在靜脈輸注后的急性生物分布。成像顯示，大部分注入的CAR-T細胞聚集在肺部和肝臟，而只有少數(shù)細胞到達腫瘤，盡管腫瘤細胞上有ErbB1-4的表達。對ErbB1-4 mRNA表達的分析證實，所有四種受體（即ErbB1-4）都在所有重要器官中表達，包括在肺部和肝臟。經(jīng)過T4-CAR-T細胞灌注的小鼠的肝臟和肺部組織的蘇木精和伊紅（H&E）染色切片顯示存在髓樣細胞浸潤，表明這些組織中存在CAR介導的炎癥。這些數(shù)據(jù)表明，肝臟和肺部是腫瘤外CAR T細胞激活的兩種關(guān)鍵器官。

為了開發(fā)一種嚴格的缺氧調(diào)控的CAR表達系統(tǒng)，這些為T4-CAR開發(fā)了一種雙缺氧感應(yīng)方法。這是通過在CAR上附加缺氧誘導因子HIF1α羧基末端長203個氨基酸的氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域（oxygen-dependent degradation domain, ODD）來實現(xiàn)的，同時在載體的長末端重復序列（LTR）增強子區(qū)域修改CAR的啟動子，使其包含一系列連續(xù)的9個缺氧反應(yīng)元件（9xHRE），從而允許HIF1α介導的CAR轉(zhuǎn)錄。這種稱為HypoxiCAR的CAR在體外顯示了CAR分子在人類T細胞細胞表面上的嚴格的缺氧特異性表達。表達HypoxiCAR的T細胞（下稱HypoxiCAR-T細胞）在低氧（0.1% O2）條件下激活時，每個細胞表達的CAR分子與組成型T4-CAR-T細胞相當。事實證明，整入HypoxiCAR的雙缺氧感應(yīng)系統(tǒng)優(yōu)于9xHRE盒（9xHRE cassette）或ODD的單缺氧感應(yīng)模塊，后者在常氧條件下表現(xiàn)出CAR表達和腫瘤細胞殺傷的不嚴密性。使用雙缺氧感應(yīng)系統(tǒng)的HypoxiCAR的表達嚴格限制在缺氧環(huán)境中，同時也是高度動態(tài)的，這代表了一種可以以O(shè)2依賴的方式開啟和關(guān)閉的開關(guān)。

這種雙缺氧感應(yīng)系統(tǒng)作為一種實現(xiàn)癌癥選擇性免疫治療的替代方法，利用了腫瘤微環(huán)境的最固有的特征之一：缺氧。它取得了令人信服的抗腫瘤療效，同時消除了識別正常組織中多個靶點時出現(xiàn)的脫靶毒性。滲入腫瘤微環(huán)境的T細胞可以向外遷移，這突出了一個潛在的安全問題：感應(yīng)缺氧的HypoxiCAR-T細胞有可能重新進入健康的常氧組織。然而，CD8+T細胞遷移已被證明在遇到表達其同源抗原的腫瘤細胞時停止，這表明，當HypoxiCAR-T細胞表達它們的CAR并與表達ErbB受體的腫瘤細胞接觸時，它們向外遷移的能力可能受到限制。此外，根據(jù)這些作者的體外觀察，CAR的表達在可能離開腫瘤時迅速減少，從而大大限制了注入的CAR T細胞在腫瘤外被激活的風險。

缺氧的腫瘤微環(huán)境不利于有效的免疫反應(yīng)，在那里，缺氧可以激活諸如巨噬細胞之類的基質(zhì)細胞的免疫抑制程序，調(diào)節(jié)免疫檢查點分子的表達，并促進更具侵襲性的腫瘤細胞表型。然而，令人鼓舞的是，這些作者發(fā)現(xiàn)缺氧并沒有對體外的T細胞效應(yīng)功能產(chǎn)生負面影響。HypoxiCAR-T細胞也能阻止缺氧性腫瘤的生長，這表明在測試的模型中，腫瘤微環(huán)境并不是HypoxiCAR效應(yīng)功能的絕對障礙。盡管這項研究中使用的HypoxiCAR-T細胞劑量并沒有完全根除SKOV3腫瘤，但腫瘤控制的喪失與駐留在小鼠體內(nèi)的HypoxiCAR-T細胞數(shù)量的明顯下降相吻合。另外，與HN3腫瘤相比，SKOV3腫瘤誘導較低的CAR總體表達，這與SKOV3腫瘤的缺氧程度相對較低一致。這些觀察結(jié)果突出了適當選擇接受HypoxiCAR-T細胞的劑量和個體以實現(xiàn)高效的抗腫瘤控制的重要考慮。

重要的是，鑒于這些作者也證實了HIF1α穩(wěn)定化程度最高和/或強度最高的腫瘤并未排除T細胞進入上皮之間的間隙，也未排除T細胞進入腫瘤的HIF1α穩(wěn)定化區(qū)域，因此很可能HypoxiCAR-T細胞應(yīng)該能夠進入合適的腫瘤微環(huán)境以激活CAR的表達。雖然他們沒有觀察到接受高治療劑量的HypoxiCAR-T細胞輸注的小鼠存在治療限制性毒性的證據(jù)，但是在健康組織中存在一些微環(huán)境，比如在腸道粘膜中已觀察到“生理性缺氧”。然而，可以在HypoxiCAR中加入一個額外的自殺開關(guān)，為臨床試驗提供額外的安全水平。

由此可見，HypoxiCAR提供了一種嚴格的、廣泛適用的策略，以克服治療實體惡性腫瘤的安全靶點缺乏的問題。

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