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·         國際分子科學(xué) 

·         第23（13）節(jié);2022 7月 

·         PMC9266774

國際分子科學(xué)雜志. 2022 7月;23(13): 6941.2022 年 6 月 22 日在線發(fā)布。

綠原酸通過調(diào)節(jié)人真皮成纖維細(xì)胞中的膠原蛋白代謝和細(xì)胞凋亡來防止UVA誘導(dǎo)的皮膚光老化

薛妮娜, 劉穎, 金晶, 紀(jì)明和 陳曉光*神田直子， 學(xué)術(shù)編輯作者信息 文章注釋 版權(quán)和許可信息 免責(zé)聲明

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抽象

皮膚老化分為受內(nèi)在和外在因素影響的按時(shí)間順序老化和光老化。本研究旨在探討綠原酸（CGA）對(duì)人真皮成纖維細(xì)胞（HDFs）的抗衰老能力及其機(jī)制。在這項(xiàng)研究中，CGA特異性地上調(diào)膠原蛋白I（Col1）mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，并在不影響細(xì)胞活力的情況下增加HDF上清液中的膠原蛋白分泌，后者在BioMAP HDF3CGF系統(tǒng)中也得到了證實(shí)。在紫外線A（UVA）誘導(dǎo)的光老化下，CGA通過增加UVA照射HDF中Col1表達(dá)和降低基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP1）和MMP3水平來調(diào)節(jié)膠原蛋白代謝。轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）介導(dǎo)的Smad2/3分子的激活，這對(duì)Col1合成至關(guān)重要， 被UVA照射抑制，但在CGA存在下增強(qiáng)。此外，CGA減少了UVA誘導(dǎo)的活性氧（ROS）的積累，減弱了DNA損傷并促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)，從而降低了UVA照射HDF的細(xì)胞凋亡�？傊�，我們的研究首次證明了CGA在皮膚光老化過程中具有保護(hù)作用，特別是由UVA照射觸發(fā)，并為進(jìn)一步研究CGA用于預(yù)防或治療皮膚老化提供了依據(jù)。 證明CGA在皮膚光老化過程中具有保護(hù)作用，特別是由UVA照射觸發(fā)，并為CGA用于預(yù)防或治療皮膚老化的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。 證明CGA在皮膚光老化過程中具有保護(hù)作用，特別是由UVA照射觸發(fā)，并為CGA用于預(yù)防或治療皮膚老化的進(jìn)一步研究提供了依據(jù)。

關(guān)鍵字： 膠原蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶、人真皮成纖維細(xì)胞、光老化、綠原酸、UVA 輻射轉(zhuǎn)到：

1. 簡(jiǎn)介

衰老是一個(gè)持續(xù)而緩慢的過程，會(huì)損害人類和動(dòng)物不同器官和系統(tǒng)的形態(tài)和功能特征[1].皮膚老化只是這一過程的一個(gè)可見部分，其特征是由內(nèi)在（例如，時(shí)間順序、荷爾蒙和遺傳）和外在環(huán)境壓力因素引起的皺紋、松弛和色素不規(guī)則的出現(xiàn)。這些組織學(xué)變化通常與真皮中角質(zhì)形成細(xì)胞和黑色素細(xì)胞過度增殖和膠原纖維降解有關(guān)[2,3].

皮膚由外表皮層和真皮內(nèi)層組成，它們通過基底膜連接。I型膠原蛋白（Col1）是最豐富的真皮細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，與膠原蛋白III（Col3）結(jié)合，在成人皮膚的真皮中形成廣泛的細(xì)胞外纖維。Col1占85-90%，而Col3在人類成人皮膚中占8-11%，后者是新生兒皮膚中更重要的成分[4].Col1 隨時(shí)間老化而降低，但可由光老化觸發(fā) [5].此外，Col1 可以通過水解蛋白質(zhì)（例如基質(zhì)金屬蛋白酶 （MMP））來降解，這些蛋白質(zhì)是降解 ECM 蛋白的普遍存在的內(nèi)肽酶家族 [6].先前的研究表明，MMP-1，MMP-2和MMP-3主要是降解膠原蛋白和彈性蛋白的MMP[7].隨著皮膚的老化過程，膠原蛋白的生物合成減少，膠原蛋白碎裂增加，這兩者都有助于膠原蛋白含量的整體減少[8,9,10].因此，近年來，許多含有膠原蛋白的營養(yǎng)補(bǔ)充劑和特色食品已經(jīng)上市，以促進(jìn)皮膚的抗衰老。

天然產(chǎn)物或分子長期以來一直用于改善皮膚外觀，例如熊果苷，森蘭茂菌提取物，壬二酸，β-羥基酸，乳酸，洋甘菊提取物和鞣花酸[11].許多這些天然小分子或提取物表現(xiàn)出抗氧化活性，并在維持體內(nèi)平衡和防止由于紫外線（UV）引起的皮膚損傷引起的光老化方面發(fā)揮作用。雖然這可以作為一般機(jī)制，但由于許多天然產(chǎn)物中的混合成分，難以識(shí)別更明確的分子介質(zhì)。綠原酸 （CGA） 是 L-奎寧酸和咖啡酸的酯，是一種天然產(chǎn)物，常見于人類飲食和由草藥、水果和蔬菜制成的飲料中 [12].它已被證明具有多種生理特性，包括抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗菌和抗腫瘤作用[13,14,15,16].有一些研究報(bào)告了CGA的抗衰老作用。例如，Li等報(bào)道CGA可能通過抑制酪氨酸酶活性來抑制B16黑色素瘤細(xì)胞中的黑色素生成，暗示CGA對(duì)皮膚色素沉著的作用[17].Cha和Her等人表明，CGA可以防止UVB輻射引起的皮膚老化[18,19,20].這些報(bào)告與CGA對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞，來自新生包皮或無毛小鼠的成纖維細(xì)胞中UVB誘導(dǎo)的光老化的保護(hù)作用有關(guān)，因?yàn)橥庠谄つw老化主要與太陽紫外線（UV）輻射暴露有關(guān)[21].然而，UVB主要導(dǎo)致表皮層的損傷。陽光中大約90-99%的長波紫外線（UVA）更深入地滲透到人體皮膚真皮組織中，因此UVA是皮膚光老化的主要因素[22].

在這方面，還沒有研究顯示CGA是否以及如何在正常和UVA誘導(dǎo)的光老化條件下保護(hù)人真皮成纖維細(xì)胞成體（HDF-α）細(xì)胞。本研究重點(diǎn)研究了CGA對(duì)HDFs的抗光老化作用，特別是在UVA輻照脅迫條件下以及與膠原蛋白代謝和細(xì)胞凋亡相關(guān)的機(jī)制。

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2. 結(jié)果

2.1. CGA對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞膠原蛋白表達(dá)的影響

首先通過蛋白質(zhì)印跡和定量RT-PCR（qRT-PCR）測(cè)定CGA對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞中膠原蛋白表達(dá)的影響。如 圖1在0.1至3μM的較低濃度下使用的A，B，CGA增加了HDF-α和CCC-ESF-1細(xì)胞中的1型膠原蛋白（Col1）蛋白表達(dá)。CGA暴露48 h對(duì)Col1蛋白表達(dá)的刺激作用更為明顯。為了檢查CGA對(duì)膠原蛋白的刺激作用是否發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，檢測(cè)了Col1（Col1A1，Col1A2）和Col3（Col3A1）mRNA表達(dá)的基因。如 圖1濃度為0.3至10μM的C-E，CGA增強(qiáng)了Col1A1和Col1A2 mRNA水平，特別是在Col1A2 mRNA表達(dá)中。CGA（1，3和10μM）的存在顯著增加了Col1A2 mRNA水平。然而，暴露CGA后Col3A1 mRNA水平幾乎沒有變化。這些數(shù)據(jù)表明CGA特異性誘導(dǎo)Col1表達(dá);這一結(jié)果歸因于Col1A2基因轉(zhuǎn)錄的促進(jìn)。

圖1

CGA對(duì)人皮膚成纖維細(xì)胞中膠原蛋白表達(dá)的影響。在HDF-α細(xì)胞中暴露CGA24或48小時(shí)后，通過蛋白質(zhì)印跡測(cè)定法檢測(cè)膠原蛋白I水平（一個(gè)） 和 CCC-ESF-1 細(xì)胞 （B).Col1A1 （C）， Col1A2 （D） 和 Col3A1 （E）在HDF-α細(xì)胞中用CGA處理48小時(shí)后，通過qRT-PCR測(cè)定法測(cè)量mRNA水平。這些值表示為三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。* p ≤ 0.05， ** p ≤0.01表示差異顯著。

2.2. CGA對(duì)HDF中膠原蛋白分泌的影響

我們接下來專注于HDF-α細(xì)胞，將其暴露于指定劑量的CGA48小時(shí)，并通過Biocolor Sircol評(píng)估細(xì)胞培養(yǎng)上清液中總膠原蛋白的分泌量測(cè)定。暴露于CGA導(dǎo)致膠原蛋白分泌的顯著誘導(dǎo)（圖2同時(shí)，通過MTT測(cè)定法檢測(cè)CGA對(duì)細(xì)胞活力的影響。 圖2B顯示，0.3至50μM之間的CGA劑量在處理24，48和72小時(shí)后幾乎不影響HDF-α細(xì)胞的增殖。結(jié)果表明CGA促進(jìn)了膠原蛋白的產(chǎn)生，而不影響HDF-α細(xì)胞的增殖。此外，在BioMAP HDF3CGF系統(tǒng)中，原發(fā)性人新生兒包皮成纖維細(xì)胞（HDF-n）在刺激前24小時(shí)接種在低血清條件下，細(xì)胞因子列于以下位置 表1 并用指定劑量的CGA再處理72小時(shí)。中描述的十六 （16） 個(gè)參數(shù) 表1 評(píng)估了CGA對(duì)HDF的影響。在這些讀數(shù)中，組織重塑分子膠原蛋白I和炎癥因子干擾素誘導(dǎo)的T細(xì)胞α化學(xué)引誘劑（I-TAC，也稱為CXCL11）在該系統(tǒng)中用CGA治療后變化最明顯（圖3A）. 濃度為10和50μM的CGA使膠原蛋白I含量增加了約17%（圖3B).

圖2

CGA對(duì)HDF-α細(xì)胞膠原蛋白分泌的影響。(一個(gè)）在CGA暴露48小時(shí)后測(cè)量HDF-α細(xì)胞上清液中的可溶性總膠原蛋白含量。B）通過MTT測(cè)定檢測(cè)用CGA處理24，48或72小時(shí)的HDF-α細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制。這些值表示為三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值±SD。** p ≤ 0.01， *** p ≤ 0.001 表示存在顯著差異。

圖3

CGA對(duì)HDF中膠原蛋白I產(chǎn)生的影響。一個(gè)BioMAP HDF3CGF系統(tǒng)用于評(píng)估CGA對(duì)參與組織重塑和炎癥的16種生物標(biāo)志物（蛋白質(zhì)）的影響。(B）用CGA處理后膠原蛋白I的相對(duì)增加百分比被量化并顯示在直方圖中。

表1

篩選研究中使用的BioMAP HDF3CGF系統(tǒng)。顯示的細(xì)胞類型在CGA存在下用環(huán)境因子培養(yǎng)和刺激72小時(shí)。測(cè)量了列出的生物標(biāo)志物讀數(shù)。

在單獨(dú)的窗口中打開

2.3. CGA 對(duì) UVA 照射 HDF 中膠原蛋白代謝的影響

皮膚光老化通常與紫外線照射有關(guān)。基于我們對(duì)非脅迫條件下HDFs的研究，我們進(jìn)一步研究了CGA對(duì)UVA照射引發(fā)的皮膚光老化的作用。特別是，我們測(cè)量了膠原蛋白的轉(zhuǎn)錄合成和降解代謝。首先，我們檢測(cè)了UVA照射的HDF-α細(xì)胞中參與不同膠原蛋白合成亞群的關(guān)鍵基因的mRNA水平。 圖4A-D顯示，UVA照射后I型膠原蛋白（Col1A1），III型膠原蛋白（Col3A1）和V型膠原蛋白（Col5A1）基因水平均顯著下調(diào)。在CGA（3和30μM）存在下，UVA照射的HDF-α細(xì)胞中的Col 1A1基因表達(dá)顯著增加（p ≤ 0.01; p ≤0.05），但CGA對(duì)Col3A1或Col5A1 mRNA水平的影響很小。我們還研究了CGA對(duì)MMP表達(dá)的影響，如MMP1，MMP3和MMP9，它們參與膠原蛋白的分解。與膠原蛋白相反，UVA照射顯著增加了MMP1和MMP3的mRNA表達(dá)（p ≤ 0.01; p ≤ 0.05; 圖4E，F(xiàn)）。然而，與單獨(dú)的UVA照射相比，CGA加UVA照射的聯(lián)合治療導(dǎo)致HDF-α細(xì)胞中MMP1和MMP3轉(zhuǎn)錄表達(dá)降低。在UVA照射的HDF-α細(xì)胞中，MMP3 mRNA水平顯著降低了3和30 μM CGA（p ≤ 0.01; p ≤0.01）。

圖4

CGA對(duì)UVA照射的HDF-α細(xì)胞中膠原蛋白I代謝的影響。Col1A1（一個(gè)）， Col1A2 （B）， Col3A1 （C）， Col5A1 （D）、MMP1 （E） 和 MMP3 （F）在UVA照射的HDF-α細(xì)胞中通過qRT-PCR檢測(cè)。數(shù)據(jù)表示三個(gè)獨(dú)立測(cè)量的平均±SD。* p ≤ 0.05， ** p ≤0.01表示差異顯著。(G） 通過蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定UVA照射的HDF-α細(xì)胞中的Col1、MMP3和纖連蛋白表達(dá)。(H）通過密度測(cè)定法定量相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)，并在直方圖中顯示。結(jié)果代表三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值。* p ≤0.05表示差異顯著。

此外，我們還分析了CGA對(duì)Col1和MMP3（圖4G，H）。與mRNA數(shù)據(jù)一致，UVA照射顯著降低了Col1蛋白，但HDF-α細(xì)胞中的CGA處理挽救了這種減少。相比之下，MMP3蛋白在紫外線照射后略有增加，但與CGA組合后下調(diào)。另一種ECM蛋白纖連蛋白的水平在UVA照射后或在HDF-α細(xì)胞中存在CGA的情況下顯示出與Col1相似的趨勢(shì)。

2.4. CGA 對(duì) UVA 輻照 HDF 中 TGF-β/Smad 信號(hào)傳導(dǎo)的影響

探索CGA誘導(dǎo)的UVA照射HDF中膠原蛋白生成的潛在機(jī)制，Smad2 / 3和ERK1 / 2分子的活化，這是膠原蛋白合成的兩個(gè)關(guān)鍵信號(hào)通路[23,24]，通過蛋白質(zhì)印跡法進(jìn)行分析。暴露于UVA輻射后，HDF-α細(xì)胞中的Smad2/3磷酸化水平降低。與僅UVA照射的HDF-α細(xì)胞相比，UVA照射和CGA聯(lián)合處理增加了磷酸化的Smad2 / 3表達(dá)。然而，暴露于UVA或與CGA組合后磷酸化ERK1 / 2的水平保持不變（圖5答，B）。

圖5

CGA對(duì)UVA照射HDF-α細(xì)胞中Smad2/3和ERK1/2信號(hào)通路的影響。(一個(gè)） 通過蛋白質(zhì)印跡法測(cè)定UVA照射的HDF-α細(xì)胞中的p-Smad2/3、Smad2/3、p-ERK1/2和ERK1/2蛋白表達(dá)。(B）通過密度測(cè)定法定量相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)，并在直方圖中顯示。數(shù)據(jù)表示為三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。* p ≤0.05表示差異顯著。

2.5. CGA 可防止 UVA 誘導(dǎo)的 HDF 細(xì)胞凋亡

紫外線照射可能引起細(xì)胞殺傷。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與未照射的HDF-α細(xì)胞（p ≤ 0.05; p ≤ 0.05） （圖6答，B）。用CGA（3和30μM）處理顯著降低了這兩種細(xì)胞的比例。例如，HDF-α細(xì)胞中晚期細(xì)胞凋亡細(xì)胞的百分比從UVA照射組的18.4%降低到30μMCGA處理組的1.8%（p ≤0.05）。因此，在UVA照射后，裂解-PARP的表達(dá)（細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵指標(biāo)）顯著增加，HDF-α細(xì)胞中CGA處理以劑量依賴性方式降低（圖6E，F(xiàn)）。

圖6

CGA對(duì)UVA照射HDF-α細(xì)胞細(xì)胞凋亡和ROS產(chǎn)生的影響。用UVA照射HDF-α細(xì)胞60分鐘，然后用CGA處理24小時(shí)，收獲用于細(xì)胞凋亡和ROS分析。(一個(gè)）細(xì)胞凋亡的百分比通過膜聯(lián)蛋白V-FTC/PI雙染色測(cè)定法測(cè)定，然后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。(B）對(duì)各種治療組中的活細(xì)胞、早期和晚期凋亡細(xì)胞以及壞死細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)表示為三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。(C）使用DCFH-DA探針通過流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定評(píng)估ROS的產(chǎn)生。(DROS平均熒光強(qiáng)度（MFI）是從三個(gè)實(shí)驗(yàn)中計(jì)算出來的，并在直方圖中顯示。* p ≤ 0.05， ** p ≤0.01表示差異顯著。(E） 裂解的 PARP 的蛋白質(zhì)表達(dá)，γ-H2UVA照射HDF-α細(xì)胞中的AX和Rad51是使用特異性抗體通過蛋白質(zhì)印跡測(cè)定法測(cè)定的。(F）通過密度測(cè)定法定量相對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)，并在直方圖中顯示。數(shù)據(jù)表示為三個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。* p ≤ 0.05， *** p ≤ 0.001 表示存在顯著差異。

2.6. CGA 抑制 UVA 誘導(dǎo)的 ROS 在 HDF 中產(chǎn)生

為了進(jìn)一步了解CGA如何抑制紫外線照射誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，我們測(cè)量了ROS的產(chǎn)生。如 圖6與對(duì)照組相比，C，D，UVA照射60 min導(dǎo)致ROS水平顯著升高（p <0.01）。然而，CGA（30μM）聯(lián)合處理顯著降低了UVA照射的HDF-α細(xì)胞中細(xì)胞ROS的積累（p <0.05）。γ-H 的水平2AX是雙鏈斷裂（DSB）最敏感的標(biāo)志物，在UVA照射后也顯著增加（圖6然而，CGA與UVA照射相結(jié)合明顯抑制了γ-H。2HDF-α細(xì)胞中的AX表達(dá)。用于DNA修復(fù)的替代生物標(biāo)志物Rad51，在UVA暴露后上調(diào)，并在CGA處理后進(jìn)一步增加（圖6E).

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3. 討論

我們的研究首次表明，CGA治療通過上調(diào)Col1 mRNA和蛋白質(zhì)水平，增加了HDF中的膠原蛋白生物合成和分泌，特別是在1型膠原蛋白中。MMP1和MMP3在HDF-α細(xì)胞中mRNA水平比MMP9高表達(dá)，分析表明CGA不影響正常HDF-α細(xì)胞中MMP1和MMP3 mRNA表達(dá)（補(bǔ)充圖 S1A，B).這些數(shù)據(jù)表明，CGA主要促進(jìn)Col1生物合成，而不是抑制其在非脅迫HDF中的降解。

陽光中的紫外線輻射被認(rèn)為是導(dǎo)致皮膚外在老化的最突出的物理因素。慢性UVA輻射導(dǎo)致光敏性，光老化和惡性皮膚腫瘤的發(fā)展[25].更重要的是，與之前的報(bào)告一致[26]，我們發(fā)現(xiàn)UVA照射通過下調(diào)Col1，Col3和Col5基因水平顯著降低膠原蛋白的產(chǎn)生，并通過上調(diào)MMP1和MMP3 mRNA水平刺激膠原蛋白降解。與CGA聯(lián)合使用顯著逆轉(zhuǎn)了UVA照射的HDF-α細(xì)胞中Col1和MMP3的表達(dá)，從而通過增強(qiáng)Col1的產(chǎn)生和抑制其降解來改善皮膚光老化。纖連蛋白是皮膚的另一個(gè)重要成分，它沿著真皮 - 表皮交界處離散沉積。CGA減弱了暴露于UVA后纖連蛋白的減少，表明CGA促進(jìn)了其他ECM產(chǎn)物的合成。

許多促纖維化生長因子和細(xì)胞因子如TGF-β、IL-4和IL-13可能與成纖維細(xì)胞的細(xì)胞膜受體結(jié)合并介導(dǎo)Col1生物合成。TGF-β是其中的主要激活劑，它誘導(dǎo)Smad 2/3與Smad 4形成異二聚體復(fù)合物，然后將這種三級(jí)復(fù)合物易位到細(xì)胞核中以激活原膠原啟動(dòng)子[27].UVA照射可以減少TGF-β I和TGF-β II受體的合成，從而抑制TGF-β/smad途徑[23].正如預(yù)期的那樣，UVA照射抑制了HDF中Smad 2/3信號(hào)分子的活化。 CGA顯著增加了UVA照射HDF中磷酸化的Smad 2/3表達(dá)。 此外，即使ERK途徑是一種重要的MAPK信號(hào)通路，其建立是為了參與Col1轉(zhuǎn)錄的激活[24]，我們的研究表明，p-ERK1/2在單獨(dú)UVA輻射或與HDF中的CGA組合中幾乎沒有變化。這些結(jié)果表明，CGA通過刺激UVA照射HDF中的TGF-β-Smad2/3信號(hào)通路來促進(jìn)Col1表達(dá)。

已經(jīng)確定，紫外線輻射通過表皮或真皮中產(chǎn)生的活性氧（ROS）引起顯著的氧化應(yīng)激。ROS的積累增加了MMP活性，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）通過膠原降解破壞[28]，但也喚起DNA損傷和細(xì)胞凋亡。因此，化妝品中的天然植物化學(xué)物質(zhì)，尤其是抗氧化劑正在穩(wěn)步增加，以防止太陽紫外線引起的對(duì)人體皮膚的氧化損傷。例如，姜黃素對(duì)UVB或UVA誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生產(chǎn)生抑制作用，并通過上調(diào)HDF中的BCL2蛋白來防止UVA介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[29,30].在我們的研究中，CGA顯著降低了γ-H2AX水平進(jìn)一步促進(jìn)了UVA照射HDFs中Rad51的表達(dá)，表明CGA處理后DNA DSBs損傷和修復(fù)功能的改善與細(xì)胞ROS產(chǎn)生的減少同時(shí)發(fā)生，導(dǎo)致UVA照射HDFs對(duì)細(xì)胞凋亡和壞死細(xì)胞的抑制。

雖然CGA減毒UVA照射HDF-α細(xì)胞凋亡或壞死的這一發(fā)現(xiàn)似乎與其在中國實(shí)體瘤1期研究中證明的抗癌療法的作用背道而馳（http://www.chinadrugtrials.org.cn （2022 年 1 月 31 日訪問），編號(hào) CTR20160113，以及美國臨床試驗(yàn)標(biāo)識(shí)符 http://clinicaltrials.gov （于2022年1月31日訪問）， NCT02728349），一致的是CGA本身不是直接的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑，也不能抑制HDF-α細(xì)胞中的增殖，如本研究所示。UVA照射可能會(huì)觸發(fā)HDF-α細(xì)胞中與其他癌細(xì)胞不同的信號(hào)通路。通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，例如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的M2復(fù)極化為M1，它引發(fā)抗腫瘤活性[15].有趣的是，在光老化的背景下，對(duì)于上述1期試驗(yàn)中的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者，我們觀察到一些患者的皮膚變得美白和明亮，主要是面部皮膚。CGA治療GBM患者血清中Col1含量的分析顯示，CGA治療后Col1含量逐漸升高（補(bǔ)充圖S2），就像我們?cè)?HDF 模型中發(fā)現(xiàn)的 Col1 增加的 CGA 一樣。目前尚不清楚用CGA治療的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者中Col1的這種增加是直接的或反饋保護(hù)作用。然而，Col1產(chǎn)生對(duì)腫瘤血管生成和腦腫瘤進(jìn)展的影響需要在進(jìn)一步的研究中闡明。

綜上所述，CGA促進(jìn)了在未輻照HDFs下Col1的合成。此外，CGA通過抑制膠原蛋白降解和增強(qiáng)膠原蛋白合成來保護(hù)HDF-α細(xì)胞免受UVA誘導(dǎo)的光老化。此外，CGA減少了UVA誘導(dǎo)的ROS的積累，減輕了DNA損傷并促進(jìn)了細(xì)胞修復(fù)。CGA對(duì)UVA誘導(dǎo)的光老化進(jìn)行光保護(hù)的潛在機(jī)制顯示在 圖7.綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)支持進(jìn)一步研究CGA是預(yù)防或治療皮膚光老化和時(shí)間老化的有效治療劑。

圖7

CGA在HDF-α細(xì)胞上的光保護(hù)示意圖。CGA通過TGF-β-Smad2/3信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)膠原蛋白1的合成，并通過下調(diào)MMP-1和MMP-3抑制膠原蛋白降解。此外，CGA減少了UVA誘導(dǎo)的ROS的積累，減弱了DNA損傷并促進(jìn)細(xì)胞修復(fù)，從而抑制了細(xì)胞凋亡。綠色虛線T條，潛在抑制;直箭頭，激活;虛線箭頭，潛在激活。ECM，細(xì)胞外基質(zhì);MMP，基質(zhì)金屬蛋白酶;活性氧，活性氧。

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4. 材料和方法

4.1. 細(xì)胞培養(yǎng)

人胚胎皮膚成纖維細(xì)胞CCC-ESF-1細(xì)胞由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心（中國北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院）提供。原代人真皮成纖維細(xì)胞-成人（HDF-α）細(xì)胞購自ScienCell研究圖書館（美國加利福尼亞州圣地亞哥）。CCC-ESF-1細(xì)胞在Dulbecco的改良Eagle培養(yǎng)基（DMEM，Gibco）中培養(yǎng)&reg;， 生命科技，加利福尼亞州卡爾斯巴德，美國），補(bǔ)充有 10% 胎牛血清 （FBS）（Gibco，賽默飛世爾科技，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）和 100 單位/mL 青霉素和 100 單位/mL 鏈霉素。將HDF-α細(xì)胞在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基（FM，ScienCell Research Laboratories，Inc.，加利福尼亞州圣地亞哥，美國，Cat. #2301）中與2%FBS，成纖維細(xì)胞生長補(bǔ)充劑（FGS，ScienCell Research Laboratories，Inc.，圣地亞哥，加利福尼亞州，美國，貓#2352）和青霉素/鏈霉素溶液一起孵育。將這些細(xì)胞在5%CO的潮濕氣氛中孵育2 在37°C。

4.2. UVA 照射

HDF-α細(xì)胞以2.5×10的密度接種5/6孔培養(yǎng)板的孔。24小時(shí)后，用PBS替換培養(yǎng)基并暴露于UVA（12J / cm2） 60 分鐘。實(shí)驗(yàn)中使用的UVA源是紫外光療儀器（PURI Materials，中國深圳），其峰值發(fā)射波長為365 nm。UVA暴露后，用PBS洗滌細(xì)胞，然后用DMSO（0.1%，對(duì)照）或CGA（3，30μM）孵育24小時(shí)以進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

4.3. 抗體和化學(xué)品

從 abcam 獲得針對(duì)膠原 1 和纖連蛋白的抗體。MMP3， 裂解帕普， Rad51， γ-H2AX， p-ERK1/2泰爾202/泰爾204、ERK、p-smad2/3、smad2/3、β-肌動(dòng)蛋白和相應(yīng)的HRP關(guān)節(jié)二抗購自Cell Signaling Technologies（美國馬薩諸塞州丹弗斯）。MTT和DCFH-DA購自Solarbio（中國上海）。綠原酸（CGA）由九章生物科技有限公司（中國成都）提供，并以適當(dāng)?shù)臐舛热芙庠贒MSO中。

4.4. 細(xì)胞活力測(cè)定

MTT（3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物）測(cè)定適用于測(cè)量CGA對(duì)體外人真皮成纖維細(xì)胞的毒性作用。將HDF-α細(xì)胞接種到96孔板中。過夜后，將細(xì)胞在37°C下用不同濃度的CGA處理24，48和72小時(shí)。 然后，將MTT（終濃度，0.5mg / mL）溶液孵育4小時(shí)。隨后，除去培養(yǎng)基并將甲臜晶體溶解在DMSO中。酶標(biāo)儀（Biotek Instruments， Inc.， Winooski， VT， USA）用于測(cè)定570nm處的吸光度。

4.5. 定量 RT-PCR （qRT-PCR） 測(cè)定

HDF-α細(xì)胞的總RNA通過Easypure RNA試劑盒（Tansgen Biotech，中國北京）提取。cDNA 是按照制造商的說明使用 TransScript 一步法 gDNA 去除和 cDNA 合成 SuperMix 試劑盒（中國北京坦斯根）獲得的。使用SYBR綠色PCR預(yù)混液試劑盒（Cat.QPK-201，日本東洋紡）和ABI PRISM 7900序列檢測(cè)系統(tǒng)（應(yīng)用生物系統(tǒng)，美國加利福尼亞州福斯特城）。用于qPCR的引物如下： 表2.GAPDH被用作內(nèi)部控制。指示的基因表達(dá)根據(jù) 2−ΔΔCt 方法。

表2

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中的引物序列。

4.6. 蛋白質(zhì)印跡測(cè)定

CGA處理的HDF-α細(xì)胞用冰冷的RIPA裂解緩沖液裂解30分鐘。通過SDS-PAGE對(duì)來自上清液的等量蛋白質(zhì)進(jìn)行，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上（密理博，伯靈頓，馬薩諸塞州，美國）。用5%BSA封閉后，用特異性一抗探測(cè)膜，并用相應(yīng)的HRP偶聯(lián)二抗進(jìn)一步處理。然后用Tanon Chemishinecence Substrates可視化蛋白質(zhì)，由Image Quant LAS 4000（GE Healthcare，皮斯卡塔韋，新澤西州，美國）記錄，并用Image J軟件進(jìn)行分析。

4.7. 可溶性膠原蛋白檢測(cè)

將HDF-α細(xì)胞以1×10的密度接種在24孔板中5 細(xì)胞/井。用或不結(jié)合不同濃度的CGA處理細(xì)胞。48小時(shí)后，收集上清液，并使用SirCol膠原蛋白測(cè)定法（Biocolor，貝爾法斯特，愛爾蘭）定量總可溶性膠原蛋白。對(duì)于這些實(shí)驗(yàn)，將從處理過的細(xì)胞中提取的 100 μL 上清液與 1 mL 天狼星紅染料（一種陰離子染料，在測(cè)定條件下與堿性側(cè)鏈膠原蛋白基團(tuán)發(fā)生特異性反應(yīng)，然后在室溫下輕輕旋轉(zhuǎn)孵育 30 分鐘。以 12，000 rpm 離心 10 分鐘后，加入 750 μL 冰冷的酸鹽洗滌試劑以除去未結(jié)合的染料。隨后，用250μL堿試劑重新溶解膠原蛋白結(jié)合的染料，并根據(jù)制造商的說明在555nm處測(cè)量吸光度（Biotek儀器公司，美國）。 使用測(cè)定中提供的I型膠原蛋白校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4.8. 生物地圖分析分析

本研究使用了八個(gè)BioMAP系統(tǒng)，以快速表征CGA功能。在BioMAP HDF3CGF系統(tǒng)中，原發(fā)性人新生兒包皮成纖維細(xì)胞（HDF-n）在低血清條件下接種24小時(shí)，然后用細(xì)胞因子刺激 表1 用指定劑量的CGA孵育72小時(shí)后，一組生物標(biāo)志物（蛋白質(zhì)）讀數(shù)在 表1 由ELISA測(cè)量。本研究中使用的方法與前面描述的方法基本相同[31].

4.9. 細(xì)胞凋亡測(cè)定

HDF-α細(xì)胞在UVA照射（12 J / cm）后用CGA處理2).孵育24小時(shí)后，收獲HDF-α細(xì)胞并重懸于100μL染色緩沖液中。然后，加入 5 μL 膜聯(lián)蛋白 V-APC 和 10 μL 碘化丙啶 （PI） 并在黑暗中孵育 5 分鐘。使用流式細(xì)胞術(shù)（BD FACSVerse）分析早期和晚期細(xì)胞凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，BD生物科學(xué)，美國加利福尼亞州圣何塞）。

4.10.細(xì)胞 ROS 檢測(cè)測(cè)定

將HDF-α細(xì)胞以3×10的密度接種在6孔板中5 細(xì)胞/井。在UVA照射（12J / cm）后立即用或沒有CGA（終濃度為3和30μM）處理細(xì)胞2).孵育24小時(shí)后，收集HDF-α細(xì)胞，并根據(jù)制造商的說明使用DCFH-DA ROS探針使用活性氧測(cè)定試劑盒（Solarbio，CA1410，中國上海）測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。將HDF-α細(xì)胞在37°C下用5%CO染色10μM DCFH-DA工作緩沖液染色30分鐘。2.然后，收獲細(xì)胞并使用BD FACSVerse進(jìn)行分析流式細(xì)胞術(shù)。

4.11. 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)表示為使用一式三份值±標(biāo)準(zhǔn)差 （S.D） 的均值。比較使用雙尾學(xué)生的 t-測(cè)試。差異被認(rèn)為在 p ≤0.05。

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確認(rèn)

作者感謝首都醫(yī)科大學(xué)北京天壇醫(yī)院膠質(zhì)瘤科李文斌和四川九章生物科技發(fā)展有限公司鄧靜、張杰的支持。

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縮寫

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補(bǔ)充材料

以下內(nèi)容可在線獲取 https://www.mdpi.com/article/10.3390/ijms23136941/s1.

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資助聲明

本研究由中國國家自然科學(xué)基金（81703566）資助。

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作者貢獻(xiàn)

概念化和方法論，N.X.和Y.L.;正式分析和數(shù)據(jù)管理，J.J.和M.J.;寫作——原始草稿準(zhǔn)備，新澤西州;監(jiān)督和項(xiàng)目管理，X.C.所有作者均已閱讀并同意已發(fā)表的手稿版本。

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機(jī)構(gòu)審查委員會(huì)聲明

不適用。

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知情同意聲明

不適用。

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數(shù)據(jù)可用性聲明

數(shù)據(jù)包含在文章中。

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利益沖突

作者聲明不存在利益沖突。

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腳注

發(fā)布者注： MDPI對(duì)已發(fā)布地圖和機(jī)構(gòu)隸屬關(guān)系中的管轄權(quán)主張保持中立。

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文章來自 國際分子科學(xué)雜志 此處提供 多學(xué)科數(shù)字出版學(xué)院 （MDPI）