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綠原酸（CGA）是由咖啡酸和L-奎尼酸形成的酯，具有廣泛生物活性，例如抗糖尿病、神經(jīng)保護等作用，已有研究報道CGA可有效抑制腫瘤生長，這在許多臨床前模型和膠質(zhì)瘤患者的II期臨床試驗中得到了證實。然而，其直接蛋白靶點和相關抗癌機制仍然未知。2024年7月6日，中國醫(yī)學科學院藥物研究所胡海宇、陳曉光團隊在Acta Pharm Sin B（IF=14.7）發(fā)表題為“Target fishing and mechanistic insights of the natural anticancer drug candidate chlorogenic acid”的研究文章，開發(fā)光親和探針PAL-CGA揭示了ACAT1是綠原酸（CGA）的關鍵靶點，并證明CGA通過阻斷ACAT1的Y407磷酸化來抑制癌癥增殖，凸顯了其在癌癥治療中的臨床潛力。

1、新型光親和標記CGA探針 PAL/CGA的設計和合成

研究者基于文獻對CGA 類似物的SAR研究，推斷奎寧酸上的羧酸部分可以在不喪失CGA活性的情況下進行修飾，由于標記分子量較大的生物素可能會顯著影響探針的活性和細胞通透性，因此采用了生物正交方法，設計合成了光親和標記CGA類似物PAL/CGA，并使用1H NMR，13C NMR和HRMS表征探針PAL/CGA的結(jié)構(gòu)（圖1）。

圖1 CGA和PAL/CGA的結(jié)構(gòu)

2、ABPP篩選PAL/CGA的蛋白靶標

首先通過細胞實驗發(fā)現(xiàn)CGA降低人黑色素瘤 A375 細胞增殖，探針PAL/CGA與CGA的抗癌活性一致，表明添加雙功能標簽不會明顯干擾母體藥物活性。進一步作者分離了A375腫瘤組織的線粒體，通過ABPP方法確定CGA的特定蛋白質(zhì)靶點，鑒定并確認其中一種捕獲的蛋白質(zhì)是線粒體ACAT1（線粒體乙酰輔酶A乙酰轉(zhuǎn)移酶1）。酶活實驗顯示CGA對ACAT1的抑制作用比陽性對照AH（ACAT1抑制劑）的更強（圖2）。

圖2 ABPP篩選PAL/CGA的蛋白靶標

3、CGA與ACAT1相互作用的驗證

通過SPR、ITC、熱位移分析（TSA）和藥物親和力響應靶標穩(wěn)定性（DARTS）驗證了CGA和ACAT1之間的親和力和結(jié)合動力學。與陽性對AH相比，CGA在較低濃度下更有效地保護 ACAT1 蛋白水解（圖3）。

圖3 體外驗證CGA與ACAT1相互作用

隨后通過2種細胞系評估了細胞裂解物和活細胞中的ACAT1-CGA相互作用，與上述使用純化重組ACAT1結(jié)果一致，DARTS測定表明CGA有效保護ACAT1蛋白免于在A375和NCI-H1299細胞裂解物中發(fā)生劑量依賴性降解。此外，使用CGA熒光探針發(fā)現(xiàn)ACAT1敲低細胞系中CGA熒光強度顯著降低，證明了ACAT1是CGA結(jié)合蛋白（圖4）。

圖4 體內(nèi)鑒定ACAT1為CGA結(jié)合蛋白

4、CGA與ACAT1的低溫電子顯微鏡（EM）結(jié)構(gòu)

先前的研究表明ACAT1的共價抑制劑AH可與ACAT1四聚體結(jié)合并將其破壞為單體，從而使酪氨酸激酶無法磷酸化和穩(wěn)定激活ACAT1。為了闡明CGA的抑制機制作者采用低溫電子顯微鏡（cryo-EM）來研究 ACAT1/CGA 復合物的結(jié)構(gòu)。結(jié)果顯示與共價抑制劑AH相反，與CGA孵育時對四聚體和單體ACAT1蛋白之間的平衡沒有影響，這表明ACAT1的活性抑制可能是由于四聚體的廣泛構(gòu)象變化，而不是將ACAT1四聚體破壞成單體。為了證實CGA直接靶向ACAT1 α螺旋腔中的Ala 401殘基，作者將Ala（A）替換為Phe（F），發(fā)現(xiàn)可以阻止CGA與ACAT1的結(jié)合，使用ITC分析也證實CGA無法與突變蛋白結(jié)合（圖5）。

圖5 CGA與ACAT1的低溫電子顯微鏡（EM）結(jié)構(gòu)

6、CGA對ACAT1功能的影響

代謝失調(diào)是癌癥的標志之一，而ACAT1是腫瘤發(fā)生的重要代謝調(diào)節(jié)劑。有研究報道上調(diào)的致癌酪氨酸激酶使ACAT1的Y407磷酸化并穩(wěn)定其活性四聚體形式，進而抑制丙酮酸脫氫酶（PDH）活性，促進糖酵解，導致腫瘤生長。因此，抑制ACAT1活性會消除ACAT1對PDH的抑制作用并減少腫瘤生長。作者發(fā)現(xiàn)CGA 處理有效抑制了 A375 和NCI-H1299細胞系中的Y407 磷酸化，增加PDH 活性，此外，CGA處理不影響四聚體的形成，但降低了四聚體ACAT1的Y407磷酸化。這些結(jié)果表明，CGA對ACAT1的抑制可能是由于Y407磷酸化的中斷，而不是將 ACAT1四聚體破壞為無活性的單體（圖6）。

圖6 CGA降低ACAT1四聚體Y407磷酸化

最后，利用異種移植裸鼠驗證CGA作用機制，發(fā)現(xiàn)ACAT1敲低的異種移植瘤生長速度和重量顯著降低，且接受CGA治療的異種移植瘤生長減緩，但CGA治療并不能進一步減少ACAT1敲低的異種移植瘤的體積和重量。此外，接受CGA治療的異種移植小鼠腫瘤中的ACAT1活性顯著降低（圖7）。

圖7 CGA降低Y407磷酸化抑制癌細胞增殖和腫瘤生長

總結(jié)

研究表明CGA是一種新型非共價ACAT1抑制劑，可有效結(jié)合ACAT1四聚體，消除Y407磷酸化，降低ACAT1活性，消除ACAT1對PDH的抑制作用，減弱癌細胞增殖和腫瘤生長（圖8）。

圖8 CGA阻斷ACAT1的Y407磷酸化來抑制腫瘤增殖

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