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(上海交通大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，上海200240)

摘要：采用化學(xué)發(fā)光法，研究了不同濃度的綠原酸溶液對(duì)3種活性氧(Reactive Oxygen Species)05·、·OH和H202的清除和抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。研究表明，綠原酸對(duì)三種活性氧均有清除作用，其清除能力與濃度呈劑量關(guān)系，還與所清除的自由基種類(lèi)有關(guān)系。綠原酸溶液濃度較大時(shí)，對(duì)三種活性氧的清除效果均明顯而且穩(wěn)定，而濃度較低時(shí)，對(duì)Oi·和·OH清除效果則不理想，甚至產(chǎn)生一定的促氧化作用。同樣，綠原酸對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化也有明顯的抑制作用，抑制效果也與濃度呈劑量關(guān)系。

關(guān)鍵詞：綠原酸；自由基；脂質(zhì)過(guò)氧化；化學(xué)發(fā)光法

中圖分類(lèi)號(hào)：R285．5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002．6630(2006)02—0128．03

生物體系中包含有大量的脂質(zhì)過(guò)氧化和自由基反應(yīng)。正常情況下，生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除呈平衡狀態(tài)，失去平衡時(shí)，在機(jī)體內(nèi)可造成多種功能行障礙與疾病的發(fā)生。脂質(zhì)過(guò)氧化嚴(yán)重破壞細(xì)胞膜的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)中的脂肪酸，使膜酶損傷導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤、化學(xué)中毒、感染、炎癥反應(yīng)、自身免疫病、輻射損傷、血管疾病、癌癥、衰老、DNA損傷等生理過(guò)程與二者有密切聯(lián)系。

綠原酸(Chlorogenic acid)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥金銀花、杜仲葉的主要有效成分，也存在于葵花籽、水果、蔬菜、大豆、小麥、咖啡豆中。研究表明，綠原酸具有清熱解毒、消炎利膽、抗菌、降血脂等生理功能。還有抗腫瘤、抑制突變等作用⋯。雖然其作用機(jī)理至今尚不十分清楚，但是大多認(rèn)為與綠原酸能夠清除自由基有一定關(guān)系。因此，本文用化學(xué)發(fā)光法對(duì)不同濃度的綠原酸在清除氧自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化方面進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1．1 儀器

SHG—D型生物化學(xué)發(fā)光測(cè)量?jī)x上海計(jì)量局實(shí)驗(yàn)工廠。

1. 2 試劑

95％綠原酸廣東中大億達(dá)洲生物科技股份有限公司；鄰苯三酚(Parogallo) 北京化學(xué)藥品有限公司；魯米諾(1umin01)、鄰菲噦啉(1，10～phenanthroline)

Sigma化學(xué)藥品公司；CuCl(分析純)、NaOH(分析純)、乙醇(分析純)、30％雙氧水、HCI(分析純) 上海試li一-f一；碳酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液(實(shí)驗(yàn)室制備)。

1．3 方法

不同濃度的綠原酸溶液與三種活性氧和脂質(zhì)過(guò)氧化的發(fā)生體系反應(yīng)，所得的發(fā)光強(qiáng)度與空白時(shí)作比較(發(fā)光值降低程度越大，說(shuō)明清除活性氧或抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力越強(qiáng)；反之，降低程度越小，說(shuō)明能力越弱)，從而說(shuō)明其清除自由基和抗脂質(zhì)過(guò)氧化的能力。

1．3．1 清除O2－·能力的檢測(cè)(在6個(gè)樣品管中分別加入100 u1的乙醇(作空白實(shí)驗(yàn))和濃度不同的待測(cè)樣品的乙醇溶液，然后均加入100u1 lmmol／L的鄰苯三酚溶液、100 u1 lmmol／L的魯米諾溶液(配置時(shí)，先用2～3滴稀氫氧化鈉溶解)，再加入碳酸鹽緩沖溶液(pH=10．28)，使反應(yīng)總體積為lml。放入樣品池，立即開(kāi)始測(cè)定。

1．3．2 清除·OH能力的檢測(cè)

在6個(gè)樣品管中分別加入100ul的乙醇(作空白實(shí)驗(yàn))和濃度不同的待測(cè)樣品的乙醇溶液，然后均加入100u13mmol／L的鄰菲羅啉溶液(配置時(shí)，先用2～3滴稀鹽酸溶鰓)、100ul 2mmol／L的CuCl溶液(配置時(shí)，先用2～3滴稀鹽酸溶解)和100 u 1 0．6％的雙氧水，再加入磷酸鹽緩沖溶液(pH7．38)，使反應(yīng)總體積為1ml。放入樣品池，立即開(kāi)始測(cè)定。

1．3．3 清除H2O2能力的檢測(cè)

在6個(gè)樣品管中分別加入100p1的乙醇(作空白實(shí)驗(yàn))和濃度不同的待測(cè)樣品的乙醇溶液，然后均加入100 ul  30％的雙氧水、100 ul lmmol／L的魯米諾溶液，再加入磷酸鹽緩沖溶液(pH7．38)，使反應(yīng)總體積為1ml。放入樣品池，立即開(kāi)始測(cè)定。

1．3．4 抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力的檢測(cè)

此方法的原理是利用羥基自由基的發(fā)生體系產(chǎn)生·OH，作為起動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的引發(fā)劑，產(chǎn)生脂過(guò)氧自由基作為體系的發(fā)光劑。發(fā)光強(qiáng)度的大小代表了反應(yīng)生成LOO·的多少，從而可以看出脂質(zhì)過(guò)氧化進(jìn)行的程度。

在6個(gè)樣品管中分別加入100u1的乙醇(作空白實(shí)驗(yàn))和濃度不同的待測(cè)樣品的乙醇溶液，然后均加入100 u1月見(jiàn)草油、100 u1 1 2mmol／L的CuCl溶液、100u1  0．6％的雙氧水，再加入磷酸鹽緩沖溶液(pH7．38)，使反應(yīng)總體積為1m1。搖勻后，放入樣品池，立即開(kāi)始測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

在一開(kāi)始的一段時(shí)間內(nèi)，綠原酸液濃度大于等于0．02mg／ml時(shí)，發(fā)光強(qiáng)度較空白值有明顯的降低，即對(duì)0j·有明顯的清除作用，而且清除程度與綠原酸溶液的濃度呈線性量效關(guān)系；而濃度小于0．02mg／ml時(shí)，對(duì)發(fā)光值強(qiáng)度的抑制作用不明顯，濃度為0．005mg／ml時(shí)甚至使發(fā)光值升高，即濃度較低時(shí)，清除作用減弱甚至產(chǎn)生促氧化作用。還可以看到，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，所有溶液的發(fā)光強(qiáng)度值都很快降低到很小，這是O2－·的壽命非常短，O2－·濃度迅速降低的原因。

2．2 對(duì)·0H的清除作用

只有綠原酸濃度為0．1mg／ml時(shí)才能對(duì)·OH產(chǎn)生明顯且穩(wěn)定的清除作用。而濃度小于0．1mg／ml時(shí)清除效果則不理想，在一定時(shí)間內(nèi)甚至產(chǎn)生促氧化作用。至于出現(xiàn)“波峰、波谷”現(xiàn)象，可能是低濃度的綠原酸，在·OH

濃度較小時(shí)促進(jìn)·OH的產(chǎn)生，·OH濃度達(dá)到一定程度時(shí)，又對(duì)其產(chǎn)生清除作用，如此反復(fù)，便產(chǎn)生此現(xiàn)象。對(duì)此過(guò)程的作用機(jī)理還有待于進(jìn)一步研究。

2．3 對(duì)H202的清除作用

在體系中加入不同濃度綠原酸溶液時(shí)，其發(fā)光強(qiáng)度較空白溶液均有明顯的降低，而且降低的程度與濃度大小的關(guān)系不大。結(jié)合表1不同濃度綠原酸對(duì)過(guò)氧化氫在2200s內(nèi)的最大清除率，說(shuō)明綠原酸溶液對(duì)活性氧H：Oz的清除能力非常強(qiáng)，0．1mg／ml的最大清除率達(dá)到95．43％，即使?jié)舛葹?．005mg／ml時(shí)，最大清除率也達(dá)到76．26％，清除效果依然非常好。

2．4 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用

綠原酸溶液有明顯的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用，而且抑制程度與濃度呈劑量關(guān)系。隨著時(shí)間的推移，大約352S后，濃度為0．005mg／ml的綠原酸液的發(fā)光值已與空白溶液接近，說(shuō)明抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用不再明顯。最后，所有濃度的發(fā)光值趨于接近，這是脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)已經(jīng)趨于停止的原因。

從結(jié)構(gòu)上看，綠原酸是由咖啡酸和奎寧酸縮合而成的酯，屬于酚類(lèi)化合物。由于分子具有鄰二酚羥基，因此具有極強(qiáng)的還原性而更易被自由基氧化I剛，從而表現(xiàn)出很好的自由基清除作用和抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用。

3 結(jié)論

綠原酸對(duì)三種活性氧均有清除作用，其清除作用與濃度呈劑量關(guān)系，還與所清除的自由基種類(lèi)有關(guān)系。綠原酸溶液濃度較大時(shí)，對(duì)三種活性氧的清除效果均明顯而且穩(wěn)定，其中0．1mg／ml的綠原酸溶液對(duì)過(guò)氧化氫的最大清除率達(dá)到95．43％；而濃度較低時(shí)，對(duì)O2－·和·OH清除效果則變差，甚至產(chǎn)生一定的促氧化作用。綠原酸也是很好的預(yù)防性抗氧化劑，可以有效清除起動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化的引發(fā)劑，從而起到抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用，其抑制程度也與濃度呈劑量關(guān)系。