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1 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院和中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)和功能國家重點實驗室，北京 100050；

youshen@imm.ac.cn (新加坡)；wangmingjin@imm.ac.cn (m .-j . w .)；houzhenyan@imm.ac.cn (z .-y . h .)；wangweida@imm.ac.cn (w .-d . w .)；ninadu@imm.ac.cn (t .-t . d .)；

angelnina@imm.ac.cn (N.-N.X .)

2 北京藥物研究所新藥機制與藥理評價研究重點實驗室

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院和中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100050

3 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院小分子免疫腫瘤藥物研發(fā)重點實驗室，北京 100050

*通信:jiming@imm.ac.cn (mj .)；chxg@imm.ac.cn (X.-G.C .) 這些作者對這項工作做出了同等貢獻(xiàn)。

摘要背景:綠原酸具有顯著的生物活性，包括抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用。然而，CHA在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的藥理作用尚未得到評估。神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種在未分化的交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中發(fā)展的癌癥。本研究旨在評估CHA對神經(jīng)母細(xì)胞瘤的抗腫瘤活性并揭示其在細(xì)胞分化中的作用機制。方法:用Be(2)- M17和SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞確認(rèn)分化表型。皮下和原位異種移植小鼠模型也用于評價CHA的抗腫瘤活性。海馬分析和代謝組學(xué)分析進(jìn)一步研究CHA及ACAT1在線粒體代謝中的作用。結(jié)果:CHA在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)Be(2)-M17和SH-SY5Y神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化。CHA抑制的線粒體ACAT1的敲低也導(dǎo)致了體內(nèi)和體外的分化特征。代謝組學(xué)分析顯示，硫胺素代謝參與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化。

結(jié)論：這些結(jié)果提供了CHA通過誘導(dǎo)分化對神經(jīng)母細(xì)胞瘤表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性的證據(jù)，其中ACAT1-TPK1-PDH通路參與了誘導(dǎo)分化； CHA是神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療的潛在候選藥物。

關(guān)鍵詞:神經(jīng)母細(xì)胞瘤；綠原酸；分化； 乙酰輔酶 a 乙酰轉(zhuǎn)移酶；維生素 b1

1.  介紹

 神經(jīng)母細(xì)胞瘤在兒童中發(fā)病率很高，是顱外神經(jīng)系統(tǒng)的實體瘤。它起源于胚胎神經(jīng)嵴，占兒童惡性腫瘤的8 %[1]. 目前，可用于高危人群的臨床療法是多模態(tài)療法，包括化療、干細(xì)胞移植、手術(shù)、放療、維甲酸治療和免疫療法。然而，這些抑制劑都不能抑制腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[2,3].因此，迫切需要進(jìn)一步研究神經(jīng)母細(xì)胞瘤的發(fā)病機制和治療方案。

 癌癥和分化停滯之間的關(guān)系已經(jīng)報道了好幾年。神經(jīng)母細(xì)胞瘤是一種從未分化的交感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)展而來的癌癥。因此，分化誘導(dǎo)療法在這種癌癥治療中是可能的 [4].迄今為止，維甲酸(RA)是最有效的誘導(dǎo)藥物神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化。用RA處理的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系顯示出ir-可逆的增殖能力降低和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中神經(jīng)侵襲形成增加[5].RA衍生物13-順式RA已迅速進(jìn)入神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床試驗，現(xiàn)已成為標(biāo)準(zhǔn)治療的一部分[6].基本原理是13-順式RA誘導(dǎo)殘余腫瘤細(xì)胞分化，降低患者化療、手術(shù)切除、骨髓移植后復(fù)發(fā)的風(fēng)險。然而，該機制尚未完全闡明[7].據(jù)報道，約25%的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者出現(xiàn)MYCN擴增(MNA),而MYCN擴增影響細(xì)胞分化過程。對于MYCN擴增的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者， 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎不是一種有效的治療選擇，因為MYCN擴增會導(dǎo)致類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療耐藥[8–10].因為神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖、分化和存活的分子機制仍未被探索，所以研究新的分化誘導(dǎo)劑和機制將具有臨床益處。綠原酸(CHA)是一種從食物和植物中提取的天然小分子，如杜仲和咖啡。據(jù)報道，它是一種基于多羥基苯酚的苯基化合物，可調(diào)節(jié)免疫腫瘤微環(huán)境，并將巨噬細(xì)胞從M2型重新極化為M1型，從而抑制腫瘤生長[11].據(jù)報道，CHA還可通過降低IL17來緩解紅斑狼瘡樣皮膚病變和關(guān)節(jié)炎[12].除了對免疫治療的作用外，研究表明CHA在肝癌和肺癌中具有良好的分化誘導(dǎo)作用， 但其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的作用尚未見報道[13].此外，我們實驗室以前的研究表明，CHA可以抑制乙酰輔酶a乙酰轉(zhuǎn)移酶(ACAT1)的活性，ACAT1在線粒體中特異表達(dá)。ACAT1是酮體 代謝和脂肪酸代謝的關(guān)鍵酶[14].據(jù)報道，ACAT1以四聚體的形式存在，其中ACAT1的Y407位點可以使四聚體更加穩(wěn)定并增強其活性，同時破壞ACAT1四聚體的穩(wěn)定性， 而ACAT1的敲除可以有效控制腫瘤的生長[15].

 在此，我們報道了神經(jīng)母細(xì)胞瘤中CHA的一種新機制。CHA通過抑制ACAT1 在體內(nèi)和體外誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化。用CHA治療或消除ACAT1恢復(fù)了神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的氧化磷酸化(OXPHOS)。我們發(fā)現(xiàn)CHA上調(diào)硫胺素焦磷酸激酶1(TPK1)的表達(dá)，后者激活硫胺素代謝途徑，增強丙酮酸脫氫酶(PDH)活性，促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化。

2.   結(jié)果

2.1 CHA在體內(nèi)外誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化

 CHA 已在復(fù)發(fā)性高級別神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者 中進(jìn)行了臨床評估 ，并顯示出初步療效 [16].CHA可能具有抗神經(jīng)母細(xì)胞瘤的抗腫瘤活性。因此，我們首先研究了CHA對神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的作用。用CHA處理一周后，5-乙炔基-2 ′-脫氧尿苷(EdU)分析顯示，與對照細(xì) 胞相比，暴露于CHA的兩種細(xì)胞系增殖緩慢(圖 1a)。令人驚訝的是，兩種成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞(Be(2)-M17和SH-SY5Y)顯示出明顯的形態(tài)學(xué)變化，包括更長的神經(jīng)突和更多的分支，以及成熟細(xì)胞的跡象(圖1b)。CHA處理24h后，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期(圖1c)。兩種細(xì)胞類型的遷移和克隆形成能力均弱于對照組(圖S1A，B)。然而，JC-1 染色，一種用于檢測線粒體膜電位的探針，在CHA刺激后沒有顯示出變化，忽略了CHA的細(xì)胞毒性(圖 S1C)。有趣 的是，在存在CHA的情況下，Be(2)-M17和SH-SY5Y 細(xì)胞中分化標(biāo)記物(MAP2和NeuN)在mRNA 和蛋白水平上均上調(diào)(圖 1d，E)。

 圖一。CHA 促進(jìn) Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞的分化。 (A)獲取了 CHA 對 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞的細(xì) 胞形態(tài)的影響的顯微圖像。比例尺:100 μm。 (B)通過流式細(xì)胞術(shù)定量測定 EdU 熒光強度。 (C) CHA 將細(xì)胞周期阻滯在 G0/G1 期。 (D)通過實時qPCR 檢測用 CHA (5 M 和 25 M)處理 24 小時的兩個細(xì)胞系 中 MAP2 和 NeuN 的相對 mRNA 水平，n = 3 。 (E)用 CHA (5 M 和 25 M)處理 24 小時的兩個細(xì)胞系中 MAP2 和 NeuN 的蛋白質(zhì) 印跡分析 ，n = 3 。對于(C –E) ，與對照組相比 ，* p < 0.05 ，** p < 0.01，*** p < 0.001，以及**** p < 0.0001。

 為了證實這些觀察結(jié)果，我們評估了CHA的體內(nèi)抗腫瘤活性。在小鼠異種移植模型中，CHA對Be(2)-M17和SH-SY5Y細(xì)胞顯示出良好的抗腫瘤活性(圖2a –D)。CHA顯著抑制了腫瘤的生長，而沒有導(dǎo)致體重減輕(圖S2A，B)。小鼠原位模型也顯示了類似的結(jié)果(圖S2C)。與對照組相比，CHA組中Ki-67表達(dá)的減少和map2分化標(biāo)記物水平的升高延緩了 腫瘤的生長(圖 2e，F(xiàn))�？傊�，CHA誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化。

2.2.  線粒體ACAT1參與CHA誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化

 在我們之前的研究中，我們發(fā)現(xiàn)CHA是線粒體ACAT1的抑制劑(圖 S3A)。我們推測線 粒體ACAT1參與了CHA誘導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化。因此，線粒體ACAT1在兩種細(xì)胞 類型中都被敲除。細(xì)胞形態(tài)類似于用CHA處理的細(xì)胞，其中細(xì)胞趨于成熟(圖3a)。沉默ACAT1延遲了細(xì)胞增殖而沒有細(xì)胞毒性(圖S3B，C),并增加了細(xì)胞中MAP2的表達(dá)(圖3b)。一 直以來，ACAT1敲除后腫瘤生長緩慢(圖3c，D)。在腫瘤組織中Ki-67的表達(dá)降低，而MAP2的表達(dá)高度上調(diào)(圖3e)。這些數(shù)據(jù)表明線粒體ACAT1參與了神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化。

 圖二。CHA 在體內(nèi)誘導(dǎo) Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 模型的分化。 (A，B)腫瘤體積和腫瘤重量在 Be(2)-M17 模型中，給小鼠施用 CHA (20 mg/kg 和 40 mg/kg，腹膜內(nèi))18 天，n = 7。 (C，D)Be(2)-M17 模型中 的腫瘤體積和腫瘤重量；小鼠腹腔注射 CHA (20 mg/kg 和 40 mg/kg)，連續(xù) 16 天， n = 6。 (E，F(xiàn))通 過免疫組織化學(xué)分析 Ki67 和 MAP2 的表達(dá)，n = 3。比例尺:100 米。對于(A –F)，* p < 0.05，** p < 0.01，** p < 0.001，*表示與對照相比。

 圖 3。ACAT1 的敲除促進(jìn) Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞在體外和體內(nèi)的分化。 (A)不存在 ACAT1 時 Be(2)- M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)。顯微圖像被捕獲。比例尺:100 μm。 (B)ACA t1 敲除細(xì)胞中分化 標(biāo)記的蛋白質(zhì)印跡分析。 β-肌動蛋白作為對照，n = 3。 (C，ACAT1 敲除 16 天的 SH-SY5Y 模型中的 腫瘤體積和腫瘤重量，n = 7。 (E)通過免疫組織化學(xué)分析 Ki67 和 MAP2 的表達(dá)，n = 3。比例尺:100 m。對于(B –E)，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001 和**** p < 0.0001，與向量組相比。

2.3. CHA恢復(fù)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的OXPHOS能力

 先前的研究報道ACAT1在線粒體中特異表達(dá)，并參與能量代謝[14,15].然后，我們使用海馬線粒體應(yīng)激試驗檢測了CHA處理的細(xì)胞中的線粒體代謝特征。如圖所示 4a、B，在用CHA處理的兩個細(xì)胞中，耗氧率(OCR)值顯著更高。在ACAT1敲除中也觀察到了這些結(jié)果 (圖4c，D)。這些數(shù)據(jù)表明，CHA通過抑制ACAT1恢復(fù)了神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中OXPHOS的水 平。

 圖 4。CHA 處理和敲除 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞中的 ACAT1 恢復(fù)了 OXPHOS。 (A，B)使用 Seahorse Bioscience 細(xì)胞外流量分析儀實時監(jiān)測經(jīng) CHA 處理的 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞的 OCR，n = 3。 (C，D)使用 Seahorse Bioscience 細(xì)胞外流量分析儀實時監(jiān)測具有 ACAT1 敲除的 Be(2)-M17 和 SH- SY5Y 細(xì)胞的 OCR，n = 3。

2.4. 硫胺素代謝參與ACAT介導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化

 為了探索 ACAT1 如何通過調(diào)節(jié)線粒體代謝來影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化，我們在缺乏 ACAT1 的情況下對 Be(2)-M17 細(xì)胞進(jìn)行了代謝組學(xué)分析，該細(xì)胞產(chǎn)生了最顯著的分化表型。使 用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判別分析(PLS-DA)分析數(shù)據(jù)，然后根據(jù) t 檢驗和可變投影重要 性(VIP)值篩選差異代謝物。p < 0.05，VIP > 1.0 的差異代謝物滿足采納標(biāo)準(zhǔn)。與載體組相 比，在正離子模式下，在 shACAT1 #2 中發(fā)現(xiàn)了 94 種差異代謝物， PCA 揭示了兩組主成分之間的 顯著差異(圖 5a，B)。

 對這些差異代謝產(chǎn)物的 KEGG 富集分析表明，嘌呤代謝和硫胺素代謝途徑被顯著激 活，其中硫胺素代謝參與丙酮酸的氧化脫羧，與細(xì)胞氧化磷酸化有關(guān)，硫胺素本身具有抗 神經(jīng)炎癥作用 16,17](圖 5 中文 –英文)。與載體相比，硫胺素在 ACAT1 敲除后顯著上調(diào)，硫 胺素產(chǎn)生的前體代謝物 5-羥乙基-4-甲基噻唑也是如此(圖 5f)。與 ACAT1 敲除的效果一致，CHA 也上調(diào) TPK1 的表達(dá)，TP k1 是催化硫胺素轉(zhuǎn)化為硫胺素焦磷酸(TPP)的關(guān)鍵酶，從而激活硫胺 素代謝(圖 5g)。由于硫胺素是 PDH 的重要輔因子，我們檢測了兩種神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中 PDH 的活性 。如圖所示 5h ，CHA 增強 PDH 酶活性 。在沒有 ACAT1 的情況下， 與載體相 比，PDH 的活性也增加了(圖 5 )。

 圖 5。敲除 ACAT1 激活硫胺素代謝并增強 PDH 活性。 (A)敲除 ACAT1 的 Be(2)-M17 的 PCA 分析，n = 6。 (B)比較不同代謝物的火山圖，n = 6。 (C)熱圖分析，n = 6。 (D，E)代謝途徑分析的結(jié)果分別顯 示在氣泡圖和矩形樹形圖中。 (ACAT1 敲除細(xì)胞的硫胺素代謝途徑中的差異代謝物， n = 6。 (G)在 CHA 處理后，TPK1 的表達(dá)增加， n = 3。 (H，I) PDH 活動。用 CHA (5 M 和 25 M)處理或 ACAT1 敲除的Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞， n = 3。對于(F – I)，* p < 0.05，** p < 0.01 和 ***與對照組相比 p < 0.001。

2.5. TPK1促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化

 由于硫胺素代謝參與ACAT1介導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化，而CHA調(diào)節(jié) PDH活性，我們重點研究TPK1與神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞分化的關(guān)系。PCAT數(shù)據(jù)庫顯示，TPK1高表達(dá)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者相應(yīng)的ACAT1低表達(dá)，表明TPK1和ACAT1之間呈負(fù)相關(guān)(圖 6a)。TPK1高表達(dá)的患者總體存活率高(圖6b)。免疫組織化學(xué)顯示，與對照組相比，在CHA處理的動物的腫瘤組織中，TPK1的表達(dá)明顯增加(圖6c)。此外，沉默ACAT1后TPK1高度表達(dá)(圖6d)。接下來，為了證實TPK1是否調(diào)節(jié)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的分化，Be(2)-M17和SH-SY5Y細(xì)胞過表達(dá) TPK1。TPK1的過表達(dá)增加了分化標(biāo)記(MAP2)的水平(圖 6e)。相反，在缺乏ACAT1的情況下，TPK1的敲除下調(diào)了MAP2的表達(dá)(圖 6f)。在功能上，PDH活性在兩種神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì) 胞系中過量表達(dá)后增強(圖 6g)。這些數(shù)據(jù)表明，CHA通過硫胺素代謝途徑促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞 瘤細(xì)胞分化(圖 6h)。

 圖 6。TPK1 促進(jìn) Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞分化。(ACAT1 數(shù)據(jù)庫顯示 ACAT1 與 TPK1 呈負(fù)相關(guān)。 (B)具有不 同 TPK1 表達(dá)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者總存活率的 Kaplan-Meier 曲線。p 值< 0.05。(C)通過 CHA 處理的腫瘤組 織的免疫組織化學(xué)，n = 3 。比例尺:100  μm。 (D)ACA t1 敲低的腫瘤組織的免疫組織化學(xué)，n = 3。 (TPK1 在 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞中的過表達(dá)，n = 3 。 (F)在 shACAT1 #2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系中敲低 TPK1，n = 3。

 (G)過表達(dá) TPK1 的 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞中的 PDH 活性，n = 3。 (H)ACA t1-TP k1-PDH 途徑的 CHA 調(diào)節(jié)促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化的模型圖。與對照相比，對于 C，* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，和**** p < 0.0001。與向量相比，對于(D –G)，* p < 0.05 ，** p < 0.01，*** p < 0.001，以及**** p < 0.0001。

3. 討論

 由于它是一種天然小分子化合物， CHA 具有優(yōu)異的安全性和抗腫瘤活性 18].然而， CHA 在 神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化中的作用尚未見報道。在這里，我們研究了 CHA 誘導(dǎo) Be(2)-M17 和 SH- SY5Y 細(xì)胞分化的潛力。基于代謝 ACAT1-TPK1-PDH 途徑闡明了 CHA 誘導(dǎo)分化的新機制。

 傳統(tǒng)上，神經(jīng)母細(xì)胞瘤通常用放射療法、分子靶向療法或免疫療法治療；但神經(jīng)母細(xì) 胞瘤具有高度異質(zhì)性，限制了其療效并導(dǎo)致耐藥。 目前，天然產(chǎn)物由于其低毒性也被列為 有希望的候選藥物。 例如，異甘草素下調(diào)細(xì)胞中的 ATP 以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[19].姜黃素可誘導(dǎo) 線粒體功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞死亡，維甲酸可誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的分化治療 20,21].據(jù)報道， 神經(jīng)母細(xì)胞瘤中 c-MYC 的過度表達(dá)阻斷了神經(jīng)母細(xì)胞瘤的分化和發(fā)育停滯，從而促進(jìn)了神 經(jīng)母細(xì)胞瘤的惡性表型[22,23].神經(jīng)母細(xì)胞瘤在良好的分化誘導(dǎo)劑的刺激下可以分化為成 熟的神經(jīng)元。研究表明， 神經(jīng)元是終末分化的細(xì)胞， 其能量完全依賴于 OXPHOS，線粒體功 能障礙導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞傾向于死亡[24].我們的研究檢測了 CHA 誘導(dǎo)的分化細(xì)胞的表型，證 明分化細(xì)胞失去了腫瘤細(xì)胞的惡性潛能，包括增殖能力下降，周期停滯在 G0/G1 期，遷移 和侵襲能力下降。

 以前的研究表明， 突變型 ACAT1 可以去乙酰化 PDH，抑制腫瘤增殖。因此，ACAT1 被認(rèn) 為是一種潛在的抗癌藥物 25,26].我們的研究表明 CHA 抑制 ACAT1 的酶活性。然而，ACAT1 與神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化的關(guān)系尚未見報道。在這里，我們報道沉默 ACAT1 促進(jìn) Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞的分化。

 研究表明， 當(dāng)干細(xì)胞致力于分化時，糖酵解代謝轉(zhuǎn)移到線粒體 OXPHOS，以滿足分化細(xì) 胞增加的細(xì)胞能量需求[27,28].從糖酵解到線粒體氧化磷酸化的代謝轉(zhuǎn)變在干細(xì)胞分化中 變得越來越重要 29].“Warburg 效應(yīng)”確保了腫瘤細(xì)胞的能量需求，同時也加速了核酸、脂肪 酸和磷脂的生物合成，以維持腫瘤細(xì)胞的生長[30,31].細(xì)胞的正常分化主要通過氧化呼吸(三 羧酸循環(huán)和氧化磷)獲得能量。腫瘤細(xì)胞的這種代謝紊亂也提供了有針對性的治療機會。線 粒體功能被稱為“腫瘤抑制因子 ”，其氧化磷酸化的恢復(fù)被認(rèn)為是治療的目標(biāo)。抑制糖酵 解的試劑已經(jīng)進(jìn)入癌癥患者的臨床試驗[32 –34].在我們的研究中，在 CHA 誘導(dǎo)的分化細(xì)胞 和 ACAT1 敲除細(xì)胞系中，PDH 活性顯著增強，OCR 結(jié)果顯示 OXPHOS 功能恢復(fù)，這表明線粒 體 OXPHOS 恢復(fù)可能是驅(qū)動神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化的重要因素。

 腫瘤環(huán)境中的營養(yǎng)可以影響癌細(xì)胞的代謝，對癌癥的發(fā)生發(fā)展有一定的影響 35,36]. 硫胺素是一種水溶性維生素，是細(xì)胞代謝中四種關(guān)鍵酶活性所必需的，包括 PDH、 α-酮戊 二酸脫氫酶、轉(zhuǎn)酮醇酶和分支 α-酮醇酶脫氫酶復(fù)合物 37].硫胺素被轉(zhuǎn)化為活性二磷酸 TPP，這是唯一已知的在 TPK1 作用下作為輔酶因子發(fā)揮作用的硫胺素磷酸酯[38,39].在我 們的研究中，代謝組學(xué)分析表明，敲除 ACAT1 可以激活硫胺素代謝途徑，這歸因于 TPK1 表 達(dá)的上調(diào)，并進(jìn)一步恢復(fù)腫瘤細(xì)胞中 PDH 的活性和 OXPHOS 的功能。然而，ACAT1 調(diào)節(jié) TPK1 表達(dá)的分子機制需要進(jìn)一步研究。

4. 材料和方法

4.1. 研究方案的倫理批準(zhǔn)

 本研究是根據(jù)世界醫(yī)學(xué)協(xié)會的道德規(guī)范(赫爾辛基宣言)以及國家立法和機構(gòu)指南進(jìn)行 的。北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)了神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者數(shù)據(jù)分析公共數(shù)據(jù)庫 (YW2018- 018-01)。動物實驗由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所和北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)動物實驗倫理委員會 批準(zhǔn)，并根據(jù)北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)動物實驗指南(00003568)進(jìn)行。

4.2. 試劑

 本研究中使用的抗體如下 :抗 MAP2 (Abcam ，劍橋 ，英國， ab32454 ，1:1000)；抗 ACAT1(細(xì)胞信號技術(shù)， 美國馬薩諸塞州波士頓，#44276，1:1000)；anti-NeuN(細(xì)胞信號技 術(shù)，美國馬薩諸塞州波士頓，#24307，1:1000)；抗 Ki67(細(xì)胞信號技術(shù)，美國馬薩諸塞州 波 士 頓 ， #9449 ， 1:500) ； 抗 TPK1 (proteintech ， 芝 加 哥 ， IL ， 美 國 ， 10942-1- AP，1:1000)；抗 β-肌動蛋白(ZSGB-BIO，中國北京，TA346894)。CHA 獲自九江生化工程技術(shù)開發(fā)公司(中國四川成都)。在細(xì)胞實驗中，將用于細(xì)胞分析的 CHA 以合適的濃度溶解 在二甲基亞砜(DMSO)中，在動物實驗中，將用于注射的 CHA 以所需的濃度溶解在生理鹽水 中。

 抗 ACAT1 的短發(fā)夾 RNA (shRNA)序列購自 IgeBio(中國廣東廣州) 。ACAT1-#1 特異性 shRNA  的  靶 序  列 為  5 ′-cgaatgaacaggacgcttatctcggagataaagcgtcctgttcatttcg- 3 ′ ，ACAT1-#2 特異性 shRNA 的靶序列為 5 ′-gcctttagtgtctggttgtactctgagtatagtacaacc  AGACTAAAGGC-3 ′ ；對照(pko. 1-puro)shrna 由 IgeBio 合成。siRNAs靶 向 TPK1 購 自 KeyGEN  BioTech( 中 國 南 京 ) 。 按 照 制 造 商 的 說 明 (Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，使用 Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染所有質(zhì)粒。

4.3. 細(xì)胞培養(yǎng)

 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞系從中國北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)研究所獲得。Be(2)-M17 細(xì)胞在 DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，SH-SY5Y 細(xì)胞在 RPMI-1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中添加了 10%胎牛血清(FBS)和適量的青霉素/鏈霉素(P/S)。細(xì)胞在 37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，環(huán)境濕度 為 5% CO2。

 通過慢病毒感染構(gòu)建 shACAT1 穩(wěn)定的細(xì)胞系。簡而言之，我們構(gòu)建了 shACAT1 質(zhì)粒， 將包裝的慢病毒轉(zhuǎn)染到 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞中，然后使用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定的 細(xì)胞系。

4.4. 公共數(shù)據(jù)庫分析

 神經(jīng)母細(xì)胞瘤 患者 的數(shù)據(jù)從 PCAT 數(shù)據(jù)庫下載”http://pedtranscriptome.org/? home(2023 年 4 月 24 日訪問) ”[40].我們使用 PCAT 數(shù)據(jù)庫分析了神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者 TPK1 和 ACAT1 的相關(guān)性， 以及 TPK1 對神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者存活率的影響。

4.5.蛋白質(zhì)印跡分析和免疫組織化學(xué)

 在含有 1%蛋白酶抑制劑混合物(TargetMol，Boston，MA，USA)的 RIPA 緩沖液(高效) (So- larbo，Suzhou，China)中， 將細(xì)胞在冰上完全裂解 30 分鐘，然后使用 BCA 蛋白質(zhì)定 量試劑盒(Beyotime Biotechnology，Shanghai，China)測定蛋白質(zhì)含量，并基于定量結(jié) 果勻漿至相同濃度。等量的蛋白質(zhì)在 SDS-聚丙烯酰胺凝膠中電泳，然后用濕法轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜上。

 PVDF 膜在 5%脫脂乳中封閉 1 小時，然后與相應(yīng)的第一抗體在 4℃孵育過夜。然后將膜與第 二抗體孵育 1 小時。使用化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(BIORAD，Hercules，CA，USA)觀察印跡。

 迅速取出腫瘤組織并在 4%多聚甲醛中固定過夜，然后制備 2 mm 厚的石蠟包埋切片。 通用兩步檢測試劑盒(ZSVB-BIO，PV-9000)用于免疫組織化學(xué)檢測。根據(jù)制造商的說明， 將 載玻片脫蠟并水合，進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉內(nèi)源性過氧化物酶，在 4 °C 的濕箱中孵育相應(yīng)的 第一抗體過夜，然后加入反應(yīng)加強液和第二抗體。DAB 顯色和蘇木精再染色后，進(jìn)行脫 水、透明和密封程序，最后在熒光顯微鏡下拍攝。

4.6. RNA提取和實時RT-PCR

 使用快速 RNA 提取試劑盒(ES Science，上海，中國)提取總細(xì)胞 RNA。定量后，將用于 qPCR 的 all-in-First-Strand cDNA synthesis SuperMix(轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)公司，北京，中國) 用于 cDNA 逆轉(zhuǎn)錄合成。最后，使用 SYBR 綠色熒光染料(轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)公司，中國北京)進(jìn)行 實時 RT-PCR。執(zhí)行的循環(huán)參數(shù)如下所列 :在 95℃初始變性 10 分鐘；15 次 95 °C 的 40 個循環(huán)；60♀C 為 10s；和 72 攝氏度持續(xù) 25 s。

4.7. 遷移分析

 用胰蛋白酶消化用 CHA (5 M 或 25 M)或 ACAT1 敲除處理的細(xì)胞，并重懸于含 1% BSA 的培養(yǎng)基中。然后，將 100 L 細(xì)胞懸浮液(20，000 個細(xì)胞)接種到 Transwell 24 孔板的上 室中(美國馬薩諸塞州 Tewksbury 的 Corning Costar ), Transwell 包括多孔聚碳酸酯膜 (孔徑為 8 μm)。下室含有 700 升補充有 20% FBS 的培養(yǎng)基。孵育 24 小時后，用 4%多聚甲 醛固定細(xì)胞，然后用棉簽從濾膜的上表面機械去除。然后用 0.1%結(jié)晶紫溶液將細(xì)胞染色 15 分鐘，用 PBS 洗滌，風(fēng)干，并在顯微鏡下成像。

4.8.軟瓊脂克隆試驗

 在這項研究中， 將 1.2%瓊脂糖和 2 種培養(yǎng)基以相等的比例混合，然后均勻地滴入六孔 板中，以制備基礎(chǔ)凝膠。CHA 處理一周后，收集細(xì)胞，將相同數(shù)量的細(xì)胞(5000)加入相應(yīng) 的 0.7%瓊脂糖和每組 2 種培養(yǎng)基的混合物中。然后，將懸浮液連續(xù)加入到六孔板中以制備 上層凝膠，并將其放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中。過夜溫育后，將細(xì)胞培養(yǎng)基(200 L)加入六孔板以 避免凝膠干燥。細(xì)胞培養(yǎng)兩周，并在顯微鏡下捕捉。

4.9.  流式細(xì)胞分析

 使用番石榴 EasyCyte 流式細(xì)胞儀(Luminex，Austin，TX，USA)進(jìn)行 EdU 和細(xì)胞周期測 定 。 在 細(xì) 胞 增 殖 的 EdU 試 驗 中 ， 細(xì) 胞 與 預(yù) 先 配 制 的 10  M  EdU (Beyotime，Nanjing，China)一起孵育 2.5 小時。EdU 與 click 反應(yīng)溶液(疊氮化物 594)化 學(xué)結(jié)合 30 分鐘。對于細(xì)胞周期評估，用丙啶(PI)對細(xì)胞進(jìn)行染色，并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行 分析。

4.10. ACAT1酶活性測定

 根據(jù)之前的研究描述在體外測定 ACAT1 活性[26].總共將 100 ng純化的 ACAT1 蛋白加 入檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)含有 50 mM Tris-HCl (pH 8.1)、20 mM MgCl2、40 mM KCl、10 M AcCoA 和 60 M CoA。使用 BioTek 分光光度計在 303 nm 的 OD 處測量吸光度。

4.11. 線粒體膜電位測量

 對于線粒體膜電位的檢測，JC-1 (Beyotime)用于評估膜電位的變化。細(xì)胞在 37℃下 在 JC-1 染色工作溶液中孵育 20 分鐘。使用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

4.12.代謝組學(xué)分析

 收集細(xì)胞并從細(xì)胞培養(yǎng)基中取出，在預(yù)冷的 PBS 中洗滌三次，用胰酶消化，收集到 1.5 mL EP 管中，離心并再次洗滌用于計數(shù)，離心后保留細(xì)胞團塊，然后快速置于液氮中 30 秒并轉(zhuǎn)移 到 80℃保存。后續(xù)代謝組學(xué)分析由上海百樹生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司(中國上海)委托進(jìn)行。

4.13.細(xì)胞代謝測量

 海馬生物科學(xué)公司的細(xì)胞外流量分析儀(XF24Seahorse Bioscience，CA，USA)用于實 時監(jiān)測細(xì)胞氧化磷酸化。簡而言之，將 10，000 個細(xì)胞接種在為 XF24 設(shè)計的 24 孔板中， 并補充 200 L 合適的生長培養(yǎng)基，并將細(xì)胞培養(yǎng)過夜。在測量之前，用含有 10 mM 葡萄 糖、1 mM 丙酮酸鈉和 2 mM 谷氨酰胺的 XF DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次；然后，將 500 L 制備好的 XF DMEM 培養(yǎng)基添加到每個孔中，并在沒有 CO2 的情況下孵育 1 小時。然后按照 海馬生物科學(xué)公司的建議，在混合(2-4 分鐘)、靜置(2 分鐘)和測量(2-4 分鐘)的典型的 8 分鐘期間測量 OCR。首先記錄基線 OCR 水平，然后記錄連續(xù)使用相關(guān)抑制劑后的 OCR 水平 : 寡霉素(0.5 M)、FCCP (1.0 M)和瑞替酮/抗霉素 A (0.5 M)。

4.14.皮下和顱內(nèi)異種移植神經(jīng)母細(xì)胞瘤模型

 Balb/c 裸鼠(雄性，6-8 周)購自北京 HFK 生物科學(xué)有限公司(中國北京)，并保存在無 病原體的動物設(shè)施中。小鼠皮下接種 1 106 個 Be(2)-M17 和 SH-SY5Y 細(xì)胞。七天后，將小 鼠隨機分為三組(n = 7)。三個組每天接受一次賦形劑、20 mg/kg CHA 和 40 mg/kg CHA 的 腹膜內(nèi)注射，共 14 天。每 3 天用測徑器測量腫瘤直徑，腫瘤體積計算為 V = 1/2 L W2， 其中 L 是腫瘤的最大長度，W 是腫瘤的最大寬度。將腫瘤解剖并固定在福爾馬林中用于免 疫組織化學(xué)分析。

 用 5 105 個 SH- SY5Y 細(xì)胞建立了神經(jīng)母細(xì)胞瘤原位異種移植模型。 簡而言之，在裸鼠 中，用微量注射器在右側(cè) 2 mm、前短膜 0.8×mm 和顱骨下 3.5 mm 處注射 5 L 細(xì)胞懸液。三 天恢復(fù)期后，將小鼠隨機分成 3 組

 并注射生理鹽水、20 毫克/千克 CHA 或 40 毫克/千克 CHA(腹膜內(nèi)注射)，每天一次，持續(xù) 14 天。每天測量小鼠的體重，當(dāng)小鼠體重減少約 20%時，進(jìn)行 MRI 分析。在掃描中用于優(yōu)化 灰質(zhì)/白質(zhì)對比度的參數(shù)如下:T2-透波希瑞， TR/TE = 5000/40；六個平均；20 ° 20 ° 的視 野；和 0.5 毫米的切片厚度。所有的大腦都被掃描了 14 次。將小鼠的大腦解剖并固定在福 爾馬林中用于 H&E 染色。

4.15. 統(tǒng)計分析

 所有數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差或 SEM 表示。數(shù)據(jù)用 t 檢驗或 ANOVA 檢驗進(jìn)行分析。使 用 Dunnett 檢驗進(jìn)行多重比較和分析。顯著性被定義為 p < 0.05。

5. 結(jié)論

 總之，我們的研究提出了 CHA 誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化的新機制。CHA 通過抑制線粒體 ACAT1 促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化。ACAT1 的消除上調(diào)了 TPK1 的表達(dá)，激活了硫胺素代謝，并 恢復(fù)了細(xì)胞中的 OXPHOS。本研究為 CHA 治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤提供了理論依據(jù)， 為神經(jīng)母細(xì)胞 瘤的治療提供了有吸引力的靶點和方案。

補充材料:以下支持信息可從以下網(wǎng)站下載 https:

//www.mdpi.com/article/10.3390/ph16060877/s1。 圖 S1:分化細(xì)胞的遷移和侵襲能力下降。； 圖 S2: CHA 降低了皮下和原位異種移植模型中的腫瘤負(fù)荷；圖 S3: CHA 抑制 ACAT1 酶活性。

作者的貢獻(xiàn):概念化， X.-G.C .和 M.J。方法論，S.Y .和 M.-J.W .軟件，s . y . t .-t . d .和 n .-n . x；驗證，s . y . m . j .和 x .-g . c；形式分析，s . y . z .-y . h .和 W.-D.W .

調(diào)查，S.Y .，n-n . x .和 M.J .x-g . c .資源；數(shù)據(jù)管理、 s . y . m .-j . w . z .-y . h .和 W.-D.W .寫作——原始草案準(zhǔn)備，S.Y .寫作——評論和編輯，M.J .和 x .-g . c；可視化，s . y . z .-y . h .和 T.-T.D .監(jiān)督，x .-g . c；x-g . c .項目管理； 資助收購，X.-G.C .所有作者 已閱讀并同意手稿的出版版本。

資助:本研究由 CAMS 創(chuàng)新基金資助，授權(quán)號 2022-I2M-1-014。

機構(gòu)審查委員會聲明 :本研究由(北京協(xié)和醫(yī)科大學(xué))PUMC 制藥機構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會批準(zhǔn)(批準(zhǔn) 號:00003568)。

知情同意書:不適用。

數(shù)據(jù)可用性聲明:數(shù)據(jù)包含在文章或補充材料中。

利益沖突:作者聲明沒有利益沖突。

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